Bu makalenin en son gözden geçirilme tarihi
Bu makalenin en son değiştirilme tarihi 3 Mayıs 2020.

Laboratuvarlar tıbben ilgilenilen sayısız analiti test eden çeşitli metodolojiler kullanmaktadır. Bir test için kullanılan yöntemin anlaşılması test sonuçlarınızın daha geniş bir bağlamda kavranmasını sağlar. Aşağıda bu sitede sıklıkla sözü edilen  birkaç laboratuvar test yönteminin açıklamasına ilişkin internet bağlantıları sunulmuştur.

Laboratuvar yöntemleri  biyoloji, kimya ve fizik alanlarında kanıtlanmış bilimsel ilkelere dayanmaktadır. Bu yöntemler kanınızdaki kolesterol miktarının belirlenmesinden, DNA’nızın analizine, enfeksiyon nedeni olabilen mikroskopik canlıların üretilmesine kadar klinik laboratuvarın her yönünü kapsamaktadır.  Bu yöntemler belli analitler veya maddeler için biyolojik numunelerin test edilmesinde kullanılan prosedürler ve süreçleri tanımlamaktadır. Laboratuvar uzmanı son ürüne ulaşılana, başka bir deyişle test sonucu alınana kadar prosedürleri adım adım izler.

Bazı yöntemler, diğerlerine göre daha zor ve emek-yoğun olup değişik derecelerde uzmanlık ister. Sıklıkla aynı maddeyi analiz etmek için birden fazla sayıda yöntem kullanılabilir. Sonuçta, aynı madde (analit) farklı laboratuvarlarda farklı farklı test edilebilir. Test sonuçlarını karşılaştırırken bu gerçek kritik önem taşır.

Aşağıda sıralanan yöntemlerin tarifleri kullanılan bilimsel ilkelere ve bir sonuç vermek için gerekli adımlara bir miktar içgörü sağlama çabası taşır. Size uygulanabilecek testlerin bir bölümünün daha iyi anlaşılması için yöntemlerin ve farklılıkların açıklamaları sunulmuştur. Burada işaret edilenler mevcut teknolojilerin kapsamlı bir listesini sunma amacı taşımamakta, bu internet sitesinde sözü edilen yöntemlerin birkaç temsili örneğini sunmaktadır.      

  • İmmünolojik analiz (IA)
  • ELISA
  • Western blot
Accordion Title
İmmunolojik Yöntemler
  • İmmunolojik analiz

    İmmünoglobulinler bağışıklık sistemi tarafından vücut içindeki yabancı maddeleri tanımak, bağlamak ve etkisizleştirmek için  üretilen proteinlerdir.  İmmünolojik analizler antikor denilen bir immünoglobülinle onun spesifik olarak tanıdığı antijen denilen yabancı molekül arasında oluşan çok özgün bağlantının varlığına dayanmaktadır. Kan veya başka vücut sıvılarında  spesifik bir antikor veya antijenin varlığını test etmek için kullanılabilir.

    İmmünolojik analizler bir kan veya sıvı numunesindeki antikorun varlığını test etmek için kullanıldığında, antikoru tespit sisteminin bir öğesi olarak test spesifik bir antijeni kullanır. Test edilmekte olan antikor numunede mevcut olduğu takdirde test sistemindeki antijenle reaksiyona girecek veya ona bağlanacak, test sonucu pozitif çıkacaktır. Anlamlı bir reaksiyon oluşmazsa numune test sonucu negatif olarak bildirilecektir.  Antikorları tespit için yapılan immünolojik testlere örnek olarak  Romatoid Faktör testi (romatoit artrit hastalarında görülen otoimmün antikorları test eder), Batı Nil Virüsü testi ( bu virüsün etkeni enfeksiyona reaksiyon olarak hastanın oluşturduğu antikorları test eder) verilebilir . Ayrıca aşılanmaya  (aşılanmanın başarılı olduğundan emin olmak için  Hepatit B virüsüne karşı oluşan antikorları test eder) cevaben oluşan antikorlar da bu testlerle tespit edilir.

    Kan veya sıvı numunesindeki antijenlerin varlığını test etmek için immünolojik analizler kullanıldığında, kullanılan kontrol testi numunesi ilgilenilen antijene karşı oluşan antikorları içerir.  Kişinin numunesinde mevcut antijenin spesifik bir antikora karşı reaksiyonu bilinen konsantrasyonlarda ve miktardaki antijenle oluşan reaksiyonla karşılaştırılıp sonuç rapor edilir.  Antijenler için yapılan immünolojik testlere örnek olarak için ilaç, hormon (insülinTSHöstrojen gibi) ve kanser belirteç (PSACA-125 ve  AFPgibi) testleri verilebilir.

    Kaynaklar
    (© 2006). Immunoassay Detection Technologies, Chapter 2. Abbott Diagnostics Scientific Resources Learning Guide [On-line information]. PDF available for download through http://www.abbottdiagnostics.com.

    Clarke, W. and Dufour, D. R., Editors (2006). Contemporary Practice in Clinical Chemistry, AACC Press, Washington, DC. Harris, N. and Winter, W. Chapter 10, Immunoassays. Pp. 117-119.

  • ELISA

    ELISA bir immünoloji analiz yöntemidir. Antijen-antikor kompleksleri oluşturmak için  antikorların çok spesifik  antijenlere bağlanacağı ilkesine dayanır. Bu kompleksleri tespit ve ölçümü için enzim bağlantılı antijenler veya antikorlar kullanılabilir.

    İnsan kanında bir antikorun tespit ve ölçümü için bilinen bir antijen bir katı maddenin yüzeyine bağlanır. Üzerine hastanın numunesini içeren bir çözelti ilave edilir. Hastanın numunesi antikor içeriyorsa antijene bağlanacaktır. Daha sonra bir enzimleişaretlenmiş ikinci bir antikor (insan antikorlarına karşı) eklenir. Enzime bağlı antikor insan antikorlarına bağlanır. Enzim, hasta numunesindeki antikorun varlığı ve miktarını gösteren saptanabilir bir değişikliğin oluşmasına yol açacaktır.

    Kaynaklar
    (© 1994-2006). Introduction to Antibodies – Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Millipore Corporation [On-line information]. Available online at http://www.chemicon.com/resource/ANT101/a2C.asp through http://www.chemicon.com.

    (2001). Gerostamoulos, J. et. al. (2001). The Use Of Elisa (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Screening In Postmortem Blood. TIAFT, The International Association of Forensic Toxicologists [On-line information]. Available online at http://www.tiaft.org/tiaft2001/lectures/l13_gerostamoulos.doc through http://www.tiaft.org.

    Clarke, W. and Dufour, D. R., Editors (2006). Contemporary Practice in Clinical Chemistry, AACC Press, Washington, DC. Harris, N. and Winter, W.

  • Western blot

    Kan veya dokudaki spesifik proteinleri saptayan bir immünanaliz yöntemidir. Bir elektroforez  aşamasıyla ayrıştırılmış proteinleri bir membrana aktaran başka bir aşamanın kombinasyonudur. Western blot testi sıklıkla,  bir  antikorun varlığını doğrulayan ve hastalığa tanı koymaya yardımcı olan bir testttir. Örneğin HIV ve  Lyme hastalığı testleri sonuçlarını doğrulamak için kullanılır.

    Bir Western blot testi için protein içeren bir numune bir jel katmanının bir ucunda bulunan bir noktaya yerleştirilir. Jelin bir ucundaki ayrı “bantlara” yan yana birçok numune ve kontrol yerleştirilebilir.  Bir elektrik akımı numunedeki (numunelerdeki) proteinlerin jel boyunca hareket etmesine neden olarak proteinleri şekil ve büyüklüklerine göre ayırır. Bakıldığında portatif merdivenin basamaklarına benzer bantlar görülür. Bu numune ve o basamakları o jelle temasa getirilen ince bir membranın (zarın ) üstüne aktarılarak bir leke oluşturulur.  Daha sonra membrana bağlanmış proteinleri tespit için bir veya iki aşamada tanımlanmış veya işaretlenmiş  antikorlar kullanılır.  Örneğin, HIV veya Lyme antikor testlerinin sonuçlarını doğrulamak için etken mikrobun proteinleri  ayrılır. Hastanın numunesi daha sonra önceden oluşan lekeye damlatılarak bu mikroba karşı oluşmuş antikorlar bağlanır. Ardından insan  immunoglobulinlerine karşı oluşmuş işaretlenmiş antikorlar kullanılarak incelenen mikrobun (örneğin HIV) antikorları tespit edilir. Belli bazı proteinlerin varlığı diğer bantlardaki bilinen negatif  veya pozitif kontrol numuneleriyle karşılaştırılarak değerlendirilir. .

    Kaynaklar
    Khalsa, G. Western blotting. Arizona State University, School of Life Sciences, Mama Ji’s Molecular Kitchen [On-line information]. Available online at http://lifesciences.asu.edu/resources/mamajis/western/western.html through http://lifesciences.asu.edu.

    Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics. Burtis CA and Ashwood ER, Bruns DE, eds. 4th edition St. Louis: Elsevier Saunders; 2006.

Accordion Title
Moleküler Tanı Yöntemleri
  • PCR

    PCR, çok küçük bir genetik materyal örneğinden çok sayıda DNA'nın kısa bölümlerinin kopyalarını yapmak için kullanılan bir laboratuvar yöntemidir. Bu işleme DNA'nın "amplifikasyonu" denir ve ilgilenilen spesifik genlerin saptanmasını veya ölçülmesini sağlar.

    DNA, dört bazın - adenin, timin, guanin ve sitozin - tekrar eden dizilerinden oluşur. Bu diziler, hidrojen bağları ile çift sarmal yapıda birbirine bağlanan iki şerit (spiral merdiven gibi) oluşturur. Sarmalın her yarısı diğerinin tamamlayıcısıdır. İnsanlarda, her DNA dizisindeki bu bazların dizilişindeki fark, her bir kişinin genetik yapısının benzersizliğine yol açar. Her bir gendeki bazların düzenlenmesi RNA üretmek için kullanılır. RNA da bir protein üretir. Bir insan genomunda yaklaşık 25.000 gen vardır ve bu genlerin ekspresyonu, vücudumuzu oluşturan çok sayıda proteinin üretimine yol açar. Bakteriler ve virüsler gibi diğer organizmaların DNA'sı da proteinlerini kodlayan binlerce farklı genden oluşur.

    Yöntem nasıl yapılır?

     PCR, bir çok adımda veya bir termal döngüleyici adı verilen bir cihazda "döngüler" halinde gerçekleştirilir. Bu cihaz prosedür sırasında örneğin sıcaklığını belirli aralıklarla artırır ve azaltır.

    1. PCR'nin ilk adımı veya döngüsü, ilgilenilen DNA'yı içeren örneğin sıcaklığını artırarak DNA çift sarmalını iki tek iplik halinde ayırmaktır. Buna DNA'yı "denatüre etme" denir.
    2. İplikler ayrıldıktan sonra örnek hafifçe soğutulur ve "ileri" ve "geri" primerler eklenir ve tekli DNA ipliklerine bağlanmasına izin verilir. Primerler, ilgili genin veya genlerin bir parçası olan ve çok spesifik baz dizisine sahip, amplifikasyona uğrayacak DNA bölümünü tanımak ve ona bağlanmak için özel olarak yapılmış kısa baz dizileridir. Primerler, DNA bölümündeki bazların kopyalandığı yöne göre "ileri" ve "geri" olarak adlandırılır.
    3. İki primer DNA'nın her bir ipliğine bağlandıktan sonra, bir DNA enzimi (sıklıkla Taq polimeraz), sarmalın her bir yarısındaki DNA dizisini ileriye doğru primerden kopyalar ve her biri bir tane orijinal yarısı ve bir yeni yarısı olmak üzere iki çift iplikli DNA parçası oluşturur. Taq polimeraz gayzerler veya kaplıcalar gibi çok sıcak suda yaşayan bir bakteride (Thermues aquaticus) bulunan bir enzimdir. Polimerazlar, yeni iplikler yapmak için DNA (veya RNA) kopyalar. Taq polimeraz, laboratuvar testleri için özellikle yararlıdır, çünkü (diğer birçok enzimin aksine) PCR yapmak için gereken çok yüksek sıcaklıklarda parçalanmaz.
    4. Isı tekrar uygulandığında, iki çift ipliğin her biri dört tek iplik yapmak üzere ayrılır ve soğutulduğunda, primerler ve polimeraz dört çift iplikli kısım yapmak üzere hareket eder. Dört iplik sonraki döngüde sekiz olur, sekiz iplik on altı olur, ve böyle artarak devam eder.
    5. 30 ila 40 döngü içinde, orijinal DNA bölümünün bir milyar kadar kopyası üretilebilir ve bunlar daha sonra çok sayıda moleküler tanı testinde kullanılabilir. Bu işlem, birkaç saat içinde orijinal DNA'nın bir milyar kopyasının üretilebilmesi için otomatikleştirilmiştir.

    Nasıl kullanılır?

    Bu yöntem, örneğin, bir kişinin DNA'sında kanser veya genetik bozukluklarla ilişkili belirli genleri tespit etmek için kullanılabilir veya bir enfeksiyona neden olan bakteri veya virüslerin genetik materyalini tespit etmek için kullanılabilir.

    Bunlar PCR yöntemi kullanılarak yapılan laboratuvar testlerinden sadece birkaçıdır:

    • JAK2
    • KRAS
    • Lyme hastalığı
    • Boğmaca
    • HPV
    • CMV
    • Gonore (Bel soğukluğu)
    • Klamidya
    • DNA Genetik parmak izi
    • Transplantasyon takibi

    Gerçek zamanlı PCR, PCR'ye benzerdir, ancak veriler, öngörülen bir son noktadan ziyade amplifikasyon işlemi gerçekleştikçe (yani, "gerçek zamanlı") elde edilir ve test süresini bir geceden birkaç saate kısaltır. Bu yöntem, bir örnekte bulunan DNA miktarını ölçmek için kullanılır.

    Kaynakça (2012)

    (February 27, 2012). Polymerase Chain Reaction (PCR). National Human Genome Research Institute [On-line information]. Available online at http://www.genome.gov/10000207. Accessed August 2012.

    Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics. Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE, eds. St. Louis: Elsevier Saunders; Fifth edition, 2011, Pp 1412-1413.

    Clarke, W. and Dufour, D. R., Editors (2006). Contemporary Practice in Clinical Chemistry, AACC Press, Washington, DC. Pp 135-137.

  • RT-PCR (Ters Transkriptaz PCR)

    Bu yöntem RNA'yı amplifiye etmek için PCR kullanır. RNA, tek iplikli bir nükleik asit molekülüdür ve amplifiye edilmeden önce DNA'ya dönüştürülmesi gerekir. RNA'yı şablon olarak kullanarak yeni bir ipliğin eklenmesi, Ters Transkriptaz (RT) adı verilen enzim ve bir antisens (ters) primer ile gerçekleştirilir. Primer tek iplikli RNA'ya bağlanır ve RT enzimi, tek iplikli bir DNA yapmak için RNA ipliğini kopyalar ve daha sonra çift iplikli bir DNA molekülü yapmak için kopyalar. Çift iplikli molekül şimdi PCR ile çoğaltılabilir.

    Tespit aynı zamanda gerçek zamanlı yöntemlerle de yapılabilir (rRT-PCR).

    RT-PCR yöntemini kullanılarak yapılan laboratuvar testleri

    • Covid-19 (SARS-CoV-2)
    • HIV viral yükü
    • HCV